Hvordan bruke GSH nivåer i Oppdager ROS

glutation , eller GSH , er en ikke-essensiell tripeptid laget av cystein , glutamat og glycin . Det er en kraftig antioksidant som beskytter celler og organer i kroppen din fra de skadelige effektene av ROS , eller reaktive oksygenforbindelser , som er dannet fra molekylært oksygen som følge av ulike metabolske prosesser i kroppen . Antioksidanter , slik som glutation , nøytralisere ROS og hindre dem fra å kommunisere med og skade på DNA og protein i cellene. Forholdet mellom oksidert og redusert form av GSH i kroppen din er veiledende av ROS - relatert oksidativt stress i body.Things du trenger
sprøyte
Butterfly nål
Sentrifuger
natriumheparin
Fryser
sulfosalicylic syre
GSH Reaction Agent
Mikro
Lyskilder
GSH standard løsning på
Vis flere instruksjoner
en

Tegn ca 2 ml blod ved venepunksjon i anticubetal venen med en 23 -gauge nål butterfly festet til en 5 ml sprøyte. Tilsett prøven for å teste rør inneholdende natrium- heparin , og sakte å vende røret for blanding .
2

samle de røde blodcellene ved sentrifugering av prøven ved 2500 omdreininger per minutt i fem minutter. Fryse og tine prøven tre ganger for å bryte cellene . Sentrifuger cellelysat løsningen i 10 minutter ved 12.000 rpm og 4 ° , og samle supernatanten.
3

fjerne protein fra prøven ved tilsetning av 5 prosent sulfosalicylic syre og sentrifugering av prøven ved 12.000 opm i fem minutter ved 4 grader . Oppbevar deproteinated supernatanten ved -112 grader.
4

Bland en tiol deteksjonsmiddel, GSH -reduktase , nikotinamid-adenin- dinukleotid -fosfat , og analysebuffer i andeler som er angitt av settet produsenten for å gjøre GSH reaksjonsblandingen. Mengden av hver kjemikalie avhenger av antall tester du har tenkt å utføre . Fortynn GSH reaksjonsblandingen i 5 prosent sulfosalicylic syre for å få konsentrasjoner på 16, 32, 63, 125, 250 og 500 mikroliter .
5

til 1 til 10 mikroliter av den deproteinated blodprøve inn i brønnene av en mikroplate . Legg seriefortynnet GSH standard løsning, som er tilgjengelig i testsettet, til hver brønn for å bringe det totale volumet av hver brønn til 10 mikroliter .
6

til 90 mikroliter av GSH reaksjonsblandingen som du har gjort i trinn 4 til hver brønn i mikroplaten . Bland -reagens ved å riste platen i 30 sekunder.
7

Mål absorbansen umiddelbart ved å plassere platen under lys med bølgelengder på 405 og 415 nanometer. Inkuber platen i 30 minutter. Ta avlesninger etter hvert femte minutt om inkubasjon .
8

Dilute 6 millimolar av prosessert prøven med 5 prosent sulfosalicylic syre og trifluromethane sulfonat løsning . Dette vil fjerne alt det reduserte GSH fra oppløsningen . Legg 1 til 10 micoliters av denne løsningen til brønnene til mikro og gjenta trinn 5 , 6 og 7 . Dette vil hjelpe anslå mengden av oksidert GSH i prøven .
9

Plott absorbans og prøven konsentrasjoner på et diagram for å oppnå den GSH -kurven for både redusert og oksidert glutation . Beregne forholdet mellom de to former av GSH . Økte nivåer oksidativt GSH nivåer indikerer oksidativt stress og ROS .