GSH analysen Protokoller

Glutathione eller GSH er et protein som finnes i både planter og dyr. De arbeider for å hjelpe enzymreaksjoner i avgiftning av miljøgifter . I tillegg , muliggjør den aminosyre transport innen cellene og bidrar til å opprettholde protein sulfhydryl- reduksjonsreaksjoner . GSH Analyseprotokollerbruke GSH buffere , standarder, substrat , enzymer og reagenser. Etter den spesifikke fremgangsmåten er relevant for resultatet av analysen. Enzymatisk Gjenvinning Metode

enzymatisk resirkulering metode , for GSH , benytter glutation reduktase å kvantifisere GSH . Denne protokollen er spesielt for plasma , vev eller dyrkede celleprøver . Tilsett reagens DTNB ( 5 -5 '- ditio -bis -2- nitrobenzoesyre ) til GSH . Den sulfhydrylgruppe i GSH reagerer med reagensen og gir en gul syre kalt 5 - tio- 2 -nitrobenzoesyre ( TNB ) . Legg glutation reduktase til syreblandingenog GSH å resirkulere GSH og produsere mer syre. I denne fremgangsmåten, er frekvensen av syreproduksjonen er proporsjonal med resirkulering omsetning av GSH ; derfor måle absorbansen til TNB -syre ved hjelp av et spektrofotometer. Absorbansen gir et anslag på den faktiske mengden av GSH i prøven .
Lever celle Glutathione analysen

Denne protokollen analyserer mengden av GSH i menneskelig hepatocarcinoma ( leverkreft ) celler. For å gjennomføre denne prosedyren , bruker kolo metode for GSH vilje til å redusere og oksidere GSH . Reduser GSH ved bruk av 5 -5 '- ditiobis (2- nitrobenzosyre eller DTNB ) for å danne den

farget produkt 2-nitro -5- tiobenzo- syre og oksydert glutation ( GSSG ) . Bruk glutation reduktase å redusere GSSG å danne GSH igjen . For å måle mengden av GSH i levercellene , lese prøven ved 415 absorbans kinetisk på en mikroplateleser .
Celle apoptose

I dette protokoll , blir GSH brukes til å detektere celle apoptose ( død) ved måling av reduksjonen i redusert GSH . En reduksjon i konsentrasjonen av cellulær GSH er et tegn på celledød. Flekk eksempel celler med ikke- fluorescerende thiolite grønt . Den thiolite grønne akkumuleres i cytosol (celle plasma) og mitokondrier ( drivkraft ) av cellen. Bruk et flowcytometer på 490/520 nanometer å visualisere mengden av GSH i cellene .
Total Konsentrasjon av GSH i dyre-og planteprøver

måle konsentrasjonen av total GSH i både redusert og oksydert form i forskjellige dyre-og planteprøver . Tilsett generelle thiolreagens , 5 -5 '- ditiobis [2- nitrobenzosyre ] . Den thiol -reagenset reagerer med GSH for å danne 412 nm kromofor , 5- thionitrobenzoic syre ( TNB ) og GS- TNB. Legg glutation reduktase -og beta - nikotinamid-adenin- dinukleotid -fosfat ( NADPH ) for å redusere GS- TNB. Den glutation vil også slippe en andre TMB molekyl og resirkulere GSH . I tillegg er en hvilken som helst oksydert GSH ( GSSG ) tilstede i blandingen fromed fra disulfidet reaksjonen også redusert til GSH . Bruk en mikroplateleser ved 405 nanometer å lese absorbans nivå og indikerer den totale konsentrasjon av GSH .