Tørking Metoder Protokoll for PVDF

Når bindende nukleinsyrer eller proteiner , en high- bindende materiale kalt PVDF ( polyvinyl difluoride ) membran gir støtte for antistoffer . Ved Western blot , blir membranene stablet sammen, klargjort for antistoffet , og deretter tørket. Protokoll for tørking membranen krever kunnskap om hvordan membraner fungerer , katodeplater , anodeplaterog anvendelse av metanol løsninger . Med riktig protokoll , membranen sikkert binder seg med det spesifikke antistoff , og er klar for umiddelbar bruk eller lagring. Klar Membrane

Klar PVDF membran renser og stabiliserer membranen før overføringen . Før tørking blir membranen " blokkert " for å hindre binding av noe annet enn de spesifikke nukleinsyrer , slik som ikke-spesifikke antistoffer. Under denne prosedyren , våt du membranen ved å legge den på et flatt underlag dekket i metanol . Membranen skifter farge i løpet av denne setningen , fra ugjennomsiktig til transparent . Når ferdig med metanol -bad, blir membranen plassert i deionisert vann for å suge i omtrent to minutter. Membranen må da suge igjen i en metanolløsning som er svært sure .
Montering av membraner Før Transfer

To av avisene membran er dynket i første metanol løsning og plassert på en anodeplate. I løpet av denne prosessen , må du nøye kontrollere for luftbobler , noe som kan kompromittere overføringen . Et annet stykke av filterpapir ble dyppet i den andre metanol-oppløsning , og plassert på toppen av stabelen. En gel går deretter på toppen av membranen , med forsiktighet for ikke å fange opp luftbobler mellom gel -programmet og membran. Tre nye papirbiter blir deretter dyppet i en katode -buffer og plassert på toppen av gelen . Hvis noen luft bobler oppstår , fungerer et reagensrør for å glatte ut membranene .
Transfer

I denne delen av prosessen , kobler du høy spenning ledninger til en strømforsyning og anvende en konstant strøm til gel -område på membranen i 30 minutter . Overføringstiden vil variere avhengig av typen av antistoff . Etter 30 minutter , fjerner du strømforsyningen og overføring membran . Den nederste høyre hjørne av membranen er da kuttet for å sjekke orientering . De to første lag av filterpapirer forkastet , inkludert gel. Bandene av molekylvekten er merket med en kulepenn .
Tørking

Når overføringen er ferdig , tørker du membranen i en av to måter . For raskere tørking , er membranen dynket i 100 prosent metanol i 10 sekunder for å fjerne alle vann. Membranen hviler deretter på et stykke tørkepapir i 15 minutter . For en langsommere tørking fremgangsmåte blir membranen plassert på et papirhåndkle uten tilsetning av metanol. Når tørket , kan membranen brukes eller oppbevares i en tørr beholder på 4 grader Celsius for fremtidig bruk .